檢測范圍：31.2 pg/ml - 2000 pg/ml

zui低檢測限：7.8 pg/ml
特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的小鼠TNF-α，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期：6 個月
預(yù)期應(yīng)用：ELISA 法定量測定小鼠血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中TNF-α
含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任
何影響。
概述
小鼠ELISA試劑盒 是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子。兔子TNF-α
基因編碼前體蛋白，其信號肽將前體蛋白固定在細(xì)胞膜上，成為具有活性的跨膜干擾素
（TNF），分子質(zhì)量為26×103，經(jīng)酶切去除信號肽生成分泌型TNF-α，分子質(zhì)量為17×103。
TNF-α細(xì)胞來源廣泛，包括各種免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、
平滑肌細(xì)胞、星形細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。
TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，如：參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，抗腫瘤，參與內(nèi)毒素性休
克等病理過程，引起惡病質(zhì)等。其具有雙重作用，,一方面在機體免疫調(diào)節(jié)，機體生理功能
和抗感染等方面發(fā)揮重要作用，另一方面若持續(xù)釋放或產(chǎn)生過多則會引起發(fā)熱!、休克、惡
病質(zhì)等，同時TNF-α可進一步誘導(dǎo)IL-6、IL-8、IL-10 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些促炎性細(xì)胞
因子參與體內(nèi)急性反應(yīng)、發(fā)熱反應(yīng)、引起趨化肽釋放等，還可使內(nèi)皮細(xì)胞活化而導(dǎo)致血管通
透性增加。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗TNF-α抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)
準(zhǔn)品、生物素化的抗TNF-α抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB 顯色。
TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺
和樣品中的TNF-α呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃
度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96 孔）。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2 瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120ul/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120ul/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof 管
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5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存
1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2 小時或4℃后于1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可
檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g 離心15
分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本
放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。
標(biāo)本的稀釋原則：
小鼠ELISA試劑盒  首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)
曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計算濃度
時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，
然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為2000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋2000
pg/ml，1000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，樣品稀釋液
直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15 分鐘內(nèi)配制。
如配制1000 pg/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）2000 pg/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml
樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制
（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul 生物素標(biāo)記抗體加990ul 生物素標(biāo)
記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：
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臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的
總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和
素加990ul 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)
配制。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。
每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試
劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標(biāo)
準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，
輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100ul（取1ul 生物素標(biāo)記抗
體加99ul 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60
分鐘。
3. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，350ul/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100ul，37℃，60
分鐘。
5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，350ul/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30 分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4 孔
有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4 孔梯度不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與
底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進
行檢測。

注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。
測量時先用此孔調(diào)OD 值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過
氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生
物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，
酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需
要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上
繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)
物的濃度與OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出
樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
小鼠ELISA試劑盒 注意事項
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
北京方程生物
6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。