一、實驗前準(zhǔn)備與試劑預(yù)混

1. 試劑解凍與平衡

   從 - 20℃冰箱取出試劑盒中的預(yù)制膠母液（含分離膠與濃縮膠預(yù)混液）、催化劑（如過硫酸銨溶液、TEMED）及電極緩沖液，室溫放置 10-15 分鐘至解凍。

• 確保所有試劑無沉淀或分層，若出現(xiàn)輕微渾濁，可輕輕顛倒混勻，避免劇烈振蕩產(chǎn)生氣泡。

2. 器材預(yù)處理

• 組裝垂直電泳槽（如 Mini-PROTEAN® 系統(tǒng)），用 75% 乙醇擦拭玻璃板內(nèi)側(cè)，去除油污與雜質(zhì)，晾干后安裝密封夾，確保玻璃板邊緣無滲漏。

二、凝膠制備與灌注

1. 一步法膠液配制

• 根據(jù)實驗需求（如分離膠濃度：常用 8%-15%），按試劑盒說明書比例取預(yù)制膠母液。例如，制備 10% 分離膠時，取 5 mL 母液加入 0.1 mL 催化劑 A（過硫酸銨）和 5 μL 催化劑 B（TEMED），立即用移液器吹打 3-5 次混勻（動作需迅速，避免膠液提前凝固）。

2. 垂直灌注分離膠

• 用 10 mL 注射器吸取混合膠液，從玻璃板間隙底部緩慢注入，至距離梳子底部約 1.5 cm 處停止（預(yù)留濃縮膠空間）。

• 立即在膠液表面覆蓋一層約 500 μL 的正丁醇或水飽和異丁醇，液面需平整，以隔絕空氣并促進(jìn)膠面凝固（約 15-20 分鐘）。

3. 制備濃縮膠

• 倒去覆蓋液，用濾紙吸干膠面殘余液體，取濃縮膠預(yù)混液（通常 4% 濃度）2 mL，加入 0.05 mL 催化劑 A 和 2 μL 催化劑 B，混勻后注入分離膠上方，至玻璃板頂端。

• 插入配套梳子，避免氣泡殘留，室溫靜置 10-15 分鐘至凝固。

三、樣品處理與上樣

1. 蛋白樣品制備

• 取細(xì)胞、組織或純化蛋白樣品，按 1:1 比例加入試劑盒提供的 2×SDS 上樣緩沖液（含 β- 巰基乙醇、溴酚藍(lán)），100℃沸水浴煮 5 分鐘，使蛋白充分變性并解離為亞基。

• 12000 rpm 離心 5 分鐘，取上清備用（避免沉淀堵塞加樣孔）。

2. 上樣操作

• 小心拔出梳子，用 1× 電極緩沖液沖洗加樣孔，去除未凝固的膠塊與雜質(zhì)。

• 用微量進(jìn)樣器按順序加入樣品（每孔 10-20 μL），同時加入預(yù)染蛋白 Marker（如 10-170 kDa）作為分子量參照，注意避免交叉污染。

四、電泳與凝膠檢測

1. 電泳參數(shù)設(shè)置

• 向電泳槽上下槽加入 1× 電極緩沖液（確保上槽液覆蓋加樣孔），連接電源，初始電壓設(shè)置為 80 V，待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后，調(diào)至 120 V 恒壓電泳（約 40-60 分鐘，具體時間取決于膠濃度與蛋白大?。?。

2. 終止電泳與凝膠回收

• 當(dāng)溴酚藍(lán)前沿接近膠底部時，關(guān)閉電源，拆卸電泳槽，用刀片小心撬開玻璃板，凝膠應(yīng)牢固附著于其中一塊板上。

• 若需染色，可直接進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色（試劑盒或自備染色液），或轉(zhuǎn)膜用于 Western blot（按常規(guī)流程操作）。

五、注意事項與關(guān)鍵控制點

• 催化劑用量精確性：過硫酸銨與 TEMED 的添加量需嚴(yán)格按說明書執(zhí)行，過量會導(dǎo)致凝膠脆性增加，不足則凝固。

• 溫度控制：凝膠凝固速度受溫度影響（25℃時最佳），低溫環(huán)境可適當(dāng)延長靜置時間，避免頻繁移動電泳槽。

• 氣泡排除：灌注膠液時需保持注射器垂直，速度均勻，若出現(xiàn)氣泡，可用針頭小心挑破或重新灌注。

• 樣品兼容性：高鹽或高濃度去污劑樣品需預(yù)先透析或稀釋，避免影響電泳分辨率。

六、流程對比與效率優(yōu)勢