組織異質(zhì)性：腫瘤組織由多種細(xì)胞類型構(gòu)成，包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，且不同細(xì)胞間的物理特性和生物學(xué)特性差異顯著。同時，腫瘤細(xì)胞本身還存在高度的異質(zhì)性，在基因表達(dá)、細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)以及細(xì)胞功能等方面均有不同。這就導(dǎo)致在制備單細(xì)胞時，很難找到一種通用的方法來高效且溫和地將所有類型的細(xì)胞分離出來，并且保證每種細(xì)胞的完整性和活性。

細(xì)胞間連接復(fù)雜：腫瘤細(xì)胞之間以及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間存在著復(fù)雜的連接結(jié)構(gòu)，如緊密連接、橋粒、黏著斑等，這些連接使得腫瘤組織具有較高的機(jī)械強(qiáng)度。要將腫瘤組織解離成單細(xì)胞，就需要破壞這些連接，但常用的解離方法如酶解、機(jī)械解離等，在破壞連接的同時，容易對細(xì)胞造成損傷，影響細(xì)胞的活性和功能。

細(xì)胞活性與功能維持：在制備單細(xì)胞的過程中，無論是酶解、機(jī)械處理還是化學(xué)處理，都可能對細(xì)胞造成一定的應(yīng)激和損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降、細(xì)胞內(nèi)信號通路改變以及細(xì)胞功能受損。而對于后續(xù)的單細(xì)胞分析實驗，如單細(xì)胞測序、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞功能檢測等，都需要細(xì)胞保持較高的活性和完整的功能，才能獲得準(zhǔn)確可靠的實驗結(jié)果。因此，如何在單細(xì)胞制備過程中地維持細(xì)胞的活性和功能，是一個關(guān)鍵的難點。

避免細(xì)胞團(tuán)聚：解離后的單細(xì)胞在懸液中容易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，這是由于細(xì)胞表面的電荷、蛋白質(zhì)等物質(zhì)相互作用，以及細(xì)胞之間的黏附力所致。細(xì)胞團(tuán)聚不僅會影響單細(xì)胞的計數(shù)和分析，還可能導(dǎo)致部分細(xì)胞被包裹在團(tuán)塊中，無法被后續(xù)的實驗所檢測到，從而造成細(xì)胞信息的丟失。防止細(xì)胞團(tuán)聚需要在解離過程中加入適當(dāng)?shù)脑噭?，如蛋白酶抑制劑、抗氧化劑等，同時還需要優(yōu)化操作流程，盡量減少細(xì)胞在懸液中的停留時間。

雜質(zhì)去除：腫瘤組織中除了細(xì)胞成分外，還含有細(xì)胞外基質(zhì)、血液成分、壞死組織等雜質(zhì)。在單細(xì)胞制備過程中，如果這些雜質(zhì)不能被有效地去除，會對后續(xù)的實驗產(chǎn)生干擾。例如，細(xì)胞外基質(zhì)可能會影響細(xì)胞的分散和貼壁，血液中的紅細(xì)胞會干擾細(xì)胞計數(shù)和分析，壞死組織中的細(xì)胞碎片可能會激活細(xì)胞的免疫反應(yīng)，影響細(xì)胞的功能狀態(tài)。因此，需要采用合適的方法去除這些雜質(zhì)，以獲得純凈的單細(xì)胞懸液。