Tiangen DP117無內毒素質粒大提試劑盒用戶指南：高純度質粒制備技術方案

一、產(chǎn)品核心特性與工作原理

1. 技術優(yōu)勢與試劑盒組成

• 核心特性：

• 高效去內毒素：采用硅膠膜吸附技術結合去內毒素系統(tǒng)，內毒素去除率＞99%，殘留量＜0.1 EU/μg DNA，符合細胞轉染及動物實驗標準；

• 超螺旋結構保留：通過溫和裂解體系（P2緩沖液）與多步離心過濾（CS1過濾器），超螺旋質粒占比＞85%，顯著提升轉染效率；

• 高通量處理：單次可處理100-200 mL菌液，高拷貝質粒得率達500-1500 μg，低拷貝質粒得率200-600 μg，滿足大規(guī)模實驗需求。

• 試劑盒組成：

• 裂解系統(tǒng)：溶液P1（含RNase A）、溶液P2（裂解液）、溶液P4（中和液）；

• 純化系統(tǒng)：平衡液BL、漂洗液PW（含無水乙醇）、無水乙醇、洗脫液TB；

• 耗材：吸附柱CP6（50 mL離心管適配）、收集管、過濾器CS1。

2. 適用范圍與兼容性

• 下游應用：

• 常規(guī)實驗：酶切、PCR、測序、連接、轉化；

• 實驗：基因治療載體構建、顯微注射、RNA干擾、CRISPR-Cas9基因編輯；

• 細胞實驗：適用于內毒素敏感型細胞（如Huh7、HEK293T）的轉染，轉染效率較普通質粒提升30%-50%。

• 質粒兼容性：

• 拷貝數(shù)：高拷貝質粒（如pUC19）推薦菌液量100 mL，低拷貝質粒（如pBR322）推薦菌液量200 mL；

• 大小范圍：支持1-20 kb質粒提取，對于＞10 kb大質粒，需增加菌液量及裂解液體積。

二、典型應用場景與實驗方案

1. 基因治療載體構建

• 實驗設計：

1. 使用DP117提取慢病毒載體骨架質粒（如pLVX-IRES-ZsGreen1），菌液量200 mL；

2. 定量檢測濃度（OD260）及純度（OD260/OD280=1.8-2.0），瓊脂糖凝膠電泳驗證超螺旋結構；

3. 結合Lipofectamine 3000轉染293T細胞，48小時后熒光顯微鏡觀察轉染效率＞80%。

• 結果示例：

• 提取的質粒濃度達1.2 μg/μL，內毒素含量0.05 EU/μg，顯著低于普通試劑盒（＞1 EU/μg）；

• 慢病毒滴度達1×10? TU/mL，較含內毒素質粒提升40%。

2. CRISPR-Cas9基因編輯

• 實驗設計：

1. 提取sgRNA表達質粒（如pX458），菌液量100 mL；

2. 通過DP117去除內毒素，避免非特異性免疫激活；

3. 核轉染HeLa細胞，72小時后T7E1酶切驗證編輯效率＞35%。

• 結果示例：

• 提取的質粒OD260/OD280=1.85，內毒素未檢出；

• 基因編輯效率較含內毒素質粒提升25%，脫靶率降低15%。

3. 動物體內實驗

• 實驗設計：

1. 提取治療性基因表達質粒（如pAAV-CMV-GFP），菌液量200 mL；

2. 通過DP117確保內毒素＜0.1 EU/μg，避免小鼠注射后發(fā)熱反應；

3. 尾靜脈注射C57BL/6小鼠（50 μg/只），7天后肝臟組織GFP熒光強度較含內毒素質粒組提升60%。

• 結果示例：

• 質粒純度（OD260/OD280=1.92）及內毒素水平符合FDA要求；

• 動物存活率100%，無炎癥反應。

三、操作規(guī)范與注意事項

1. 實驗前準備

• 試劑配制：

1. 溶液P1：加入RNase A后混勻，4℃保存；

2. 漂洗液PW：按標簽要求加入無水乙醇；

3. 洗脫液TB：65-70℃預熱以提高洗脫效率。

• 儀器校準：

• 離心機：確保轉速誤差＜2%（8000 rpm對應8228×g）；

• 移液器：定期校準，避免體積誤差。

2. 操作流程

• 菌體收集：

1. 100-200 mL菌液8000 rpm離心3分鐘，棄上清；

2. 菌體沉淀用吸水紙吸干殘留培養(yǎng)基。

• 裂解與中和：

1. 加入8 mL溶液P1，渦旋振蕩至菌體懸??；

2. 加入8 mL溶液P2，溫和翻轉6-8次，室溫放置5分鐘；

3. 加入8 mL溶液P4，立即翻轉6-8次，室溫放置10分鐘。

• 過濾與純化：

1. 裂解液8000 rpm離心5分鐘，上清倒入過濾器CS1，緩慢推動推柄過濾；

2. 濾液加入0.3倍體積異丙醇，分兩次過吸附柱CP6；

3. 依次加入10 mL漂洗液PW、3 mL無水乙醇洗滌，8000 rpm離心2分鐘棄廢液；

4. 空柱8000 rpm離心5分鐘，去除乙醇殘留。

• 洗脫與保存：

1. 吸附柱置于新收集管，加入1-2 mL預熱洗脫液TB，室溫放置5分鐘；

2. 8000 rpm離心2分鐘，收集質粒溶液，-20℃保存。

3. 實驗后處理

• 廢棄物處理：

• 含內毒素的菌體沉淀及濾液按生物危害品處理；

• 染菌的耗材121℃高壓滅菌30分鐘。

• 儀器維護：

• 吸附柱CP6為一次性耗材，禁止重復使用；

• 離心機轉子用70%乙醇擦拭，避免腐蝕。

四、常見問題解答

Q1：提取的質粒濃度低如何解決？
A：

1. 檢查菌液OD600值，推薦高拷貝質粒1.8-2.0，低拷貝質粒2.0-2.5；

2. 確保菌體懸浮，避免裂解不充分；

3. 延長洗脫時間至10分鐘，或重復洗脫一次。

Q2：內毒素殘留超標怎么辦？
A：

1. 確認溶液P4與CS1過濾器未過期；

2. 裂解液離心時間延長至15分鐘，確保內毒素充分沉淀；

3. 使用LAL法驗證內毒素水平，必要時增加乙醇洗滌次數(shù)。

Q3：如何提高大質粒（＞10 kb）的得率？
A：

1. 菌液量增加至300 mL，裂解液P1/P2/P4按比例增加至12 mL；

2. 洗脫液TB預熱至70℃，洗脫體積增加至3 mL；

3. 吸附后靜置10分鐘再離心，增強結合效率。